類器官實現候選疫苗快速檢測

2023年4月12日，康奈爾大學Matt DeLisa 教授團隊與喬治亞理工學院 Ankur Singh教授團隊共同通訊，在 ACS Central Science 上發表了題為 “Profiling Germinal Center-like B Cell Responses to Conjugate Vaccines Using Synthetic Immune Organoids” 的文章。該項工作初步展示了免疫類器官平臺具有加速綴合物疫苗研發的潛力。

這項工作得到了比爾和梅琳達蓋茨基金會（Bill and Melinda Gates Foundation）、美國國防威脅降低局 （the Defense Threat Reduction Agency）、美國國立衛生研究院、Wellcome Leap HOPE 計劃和美國國家科學基金會的支持。

摘 要

該研究開發了一種含有初始B細胞的合成類器官，合成了用于治療土拉菌（又稱“兔熱”）的糖綴合物疫苗，選取兩種候選蛋白載體的（糖）綴合物疫苗（CRM197是已知強免疫原，MBP是已知較弱免疫原），研究糖綴合物是否能夠在免疫類器官中形成生發中心(Germinal Center, GC），并刺激初始B細胞增殖、分化形成漿細胞產生特異性抗體。

研究表明，B細胞在免疫類器官模型與免疫小鼠模型中的響應相似，均能增強GC標志物表達、BCR成簇、細胞內信號傳導和體細胞超突變等。同時，免疫類器官模型也展示了初始B細胞增殖、分化為漿細胞過程中的生化指標的變化。因此，此模型不僅能夠用于篩選糖綴合物疫苗，還能對不同類型疫苗引起的特異性免疫反應和產生抗體進行機理研究。此外，相較于數周數月的免疫小鼠模型，免疫類器官模型能在更短的時間內（4天）完成初步疫苗測試轉化。這些研究結果均凸顯出免疫合成類器官的潛力，能夠快速預測疫苗的有效性，并加快抗原特異性抗體的開發。

1.糖綴合物誘導抗原特異性抗體生成

小鼠體內給藥三次，相對于不帶多糖的綴合物，糖綴合物CRM197-FtO-PS能夠生成更多的FtLPS- IgG特異性抗體，同時CRM197-FtO-PS的免疫原性顯著優于MBP-FtO-PS，原因可能是前者的多糖更長或者前者的蛋白載體的免疫原性更強（圖1b）。而對于載體蛋白誘導生產的特異性抗體MBP- IgG/ CRM197 -lgG特異性抗體，相對于PBS，均生成了3 lg以上的特異性抗體，此時擴展的多糖結構不會影響特異性抗體的生成（圖1c）。

圖 1 糖綴合物在體內不同程度地誘導抗原特異性抗體生成

2.糖綴合物在類器官上展現出增強型GC效應

從野生型小鼠的脾臟中分離初始B細胞，并將其與基質40LB細胞在含有細胞黏附肽” REDV”的水凝膠中混合，滴加入96孔板后加入交聯劑固化培養，形成高通量類器官篩選平臺。其中，基質40LB細胞來源于基因工程小鼠的3T3成纖維細胞，能夠表達T細胞信號的CD40L和B細胞激活因子（BAFF）的濾泡樹突狀細胞信號（圖2a）。

4天后，酶解水凝膠，發現80%的B細胞成GC表型(CD19+ GL7+)；B細胞活化表型特征-CD86表達顯著上調，且相較于MBP載體蛋白，CRM197誘導的CD86表達量更高，說明CRM197更有助于B細胞的成熟；最后，CRM197-FtO-PS誘導的中心細胞表型CXCR4loCD86hi (亮區，增殖緩慢的B細胞)/中心母細胞表型CXCR4hi CD86lo (暗區，增殖迅速的B細胞)的表達值明顯高于MBP-FtO-PS或CRM197載體蛋白，說明CRM197-FtO-PS誘導的B細胞更早離開生發中心，結束增殖；進而B細胞進入分化階段，CRM197-FtO-PS誘導的CD138+漿母細胞顯著高于MBP-FtO-PS或載體蛋白，且CRM197，再次驗證了MBP的低免疫原性（圖2b-2e）。

圖2 糖綴合物在合成類器官中形成的GC類B細胞亞群

3.糖綴合物誘導的GC樣B細胞BCR成簇和信號轉導

B細胞一旦與抗原結合，BCR信號通路和B細胞表面的納米結構均將調控B細胞的活化。糖綴合物CRM197-FtO-PS誘導的lgM表達值顯著相對于載體蛋白CRM197，且從空間上看，每個B細胞上的BCR簇同樣多于載體蛋白CRM197，表明糖綴合物能夠增強BCR的表達與成簇（圖3a-3b）。分析BCR信號轉導通路的關鍵激酶BTK（布魯頓氏酪氨酸激酶）和B細胞成熟下游的核轉錄因子NF-kB（核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強），結果表明CRM197-FtO-PS和CRM197誘導的BTK和NF-Kb顯著高于MBP197-FtO-PS和MBP，同蛋白載體的綴合物中，糖綴合物的表達量高于蛋白載體本身，結果表明綴合物的蛋白載體和拓展的多糖結構均影響著BTK和NF-Kb的活化。接下來，分析GC效應相關因子的表達，均證實以CRM197為載體蛋白的綴合物中，FtO-PS多糖結構顯著促進GC活化（圖3d）。

圖 3 糖綴合物在合成類器官上誘導的BCR成簇和信號轉導

4.免疫類器官發現高親和力的單克隆抗體

在初步證實GC類器官能夠保持GC樣B細胞的一些核心結構特征和功能，特別是體細胞高頻突變刺激生成多樣化的免疫球蛋白后，團隊進一步研究是否可以利用載體蛋白或糖綴合物刺激的免疫類器官，得到對CRM197或FtO-PS具有高親和力和特異性的單克隆抗體（圖4a）。篩選上清液中的96種抗原特異性結合物，得到對CRM197和FtO-PS具有親和力和特異性的單克隆抗體分別有46和62個。從中各挑選出3種最強的抗原特異性結合物進行定量ELISA實驗，6種克隆均展現出對各自抗原的高親和力（圖4b）。進一步分析類器官來源的克隆體與各自種系的序列同源性，發現VH和VL序列保持了63-95%的相似性（圖4c），此外，每個克隆都含有10個以上的種系突變。這些同源性和種系突變研究展示了從種系到親和力成熟的抗體結構的免疫學演變。

圖 4 免疫類器官促進抗原特異性單克隆抗體的發現

總的來說，疫苗研制是一個漫長的過程。利用動物模型評估疫苗的安全性及其預防疾病的潛力是不可缺少的一個環節，其免疫反應周期大約需要兩個月。而在本研究中，通過類器官模型，可以實現對候選疫苗的更高通量的篩選和評估，并且能在更短的時間內完成初步測試，加快疫苗研發的進度。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acscentsci.2c01473